PRACTICA: 7
DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA
Objetivo:
Determinar cuantos gr
de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante, para tener un diagnostico
clínico ya que se pueden variar diversas enfermedades debido a un valor anormal
de Hemoglobina.
Fundamento:
La hemoglobina es una proteína conjugada que
sirve para el transporte de oxígeno y dióxido de carbono. La masa total de
eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. De hemoglobina capaces de
transportar 800ml de oxígeno.
Una molécula de hemoglobina consta de 2 pares
de cadenas polipepticas (unión de aminoácidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM
que contienen cada uno un átomo de fe en estado ferroso. Cada punto HEM se
localiza en una zona determinada de una de las cadenas de polipepticos. Localizando
cerca la superficie de la molécula, el HEM se combina de forma reversible con
una molécula de oxigeno y dióxido de carbono. Este grupo HEM es el responsable
del del color rojo de la hemoglobina (hb).
La parte proteica o globina tiene 4 cadenas
polipeptidicas que se denominan con las letras α, β, γ, δ. Existe una cadena
mas la ε que esta presente durante los 3 primeros meses de vida se diferencian
unas de las otras en el numero o posición (de los aminoácidos de los que están
compuestas). Por lo tanto existen varios tipos de hb. en el ser humano se
pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:
Hemoglobina A: consat de 2 cadenas α y 2
cadenas β en un adulto normal corresponde a mas del 95% del total.
Hemoglobina A´: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas
δ en un adulto sano esta en porción menor de 3%.
Hemoglobina F (fetal): consa de 2 cadenas α y
2 cadenas γ. Es la hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes del
embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor
afinaidad por el oxigeno.
Hemoglobina Gower: consa de 2 cadenas α y 2
cadenas ε. Desaparece casi por completo en el tercer mes de embarazo y empieza
a aparecer la Hb fetal.
Algunos datos se obtiene exmainando a simple
vista una muestra de sangre. Un aspecto normal del suero o del plasma revela
que el pigmento esta en los glóbulos rojos. Si se agita en una sangre total
normal en el aire durante 15 min. Adquere un color rojo claro por convertir la
Hb en oxihemoglobina.
La sangre tiene un color rojo cereza brillante
cuando el pigmento es carboxi-hemoglobina en la intoxicación por CO. El color
es chocolate en la metahemoglobulemia y la banda malvada en
alsulfohemoglobulemia.
Las distintas Hb tienen espectros de absorción
características a las que determina en un espectofotometro. La identificación
de difrenetes formas de la Hbcon la determinación de sus espectros de absorción
puede hacerse de una manera sencilla
Material y Equipo:
·
Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.
·
Una pipeta de
vidrio graduada de 5 mL
·
Pipeta semiautomática
·
Tubos de ensayo.
·
Cubetas cuadradas.
·
Gradilla
·
gasa
Reactivos:
·
EDTA
·
Reactivo Drabkin
·
Ferrocianuro de potasio
·
Cianuro de potasio
·
Bicarbonato de potasio
·
Solución estándar de
cianometahemoglobina
Reactivos biológicos:
·
Sangre venosa con EDTA.
Técnica:
1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente
5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P).
2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con
anticoagulante (EDTA).
3.- Mezclar perfectamente la sangre problema,
por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra.
4.-Con una pipeta automática o pipeta de
Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la
punta de la pipeta.
5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se
vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se
mezcla.
6.- Mezcle la solución de Drabkin con la
sangre por inversión y con mucha precaución (utiliza parafilm para tapar los
tubos, recuerda que el reactivo tiene cianuro, el cual es un VENENO).
7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5
minutos. Para que se efectúe la
reacción.
8.-Después de ese tiempo se observara una
coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca que se
encuentra y se procede la lectura.
9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540
nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.
Antes de hacer la medición con
el espectrofotómetro hacer el siguiente procedimiento
PARA HACER LA MEDICION DE TRANSMITANCIA HACER EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO:
Medición de Transmitancia:
1.- Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después seleccione la longitud de onda deseada (540
nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>. Aparecerá en la pantalla el valor numérico.
2.-Presine < %T> para Transmitancia.
Aparecerá en la pantalla “T”.
3.-Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y
oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0
T.
4.-Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y
cierre la puerta.
Aparecerá en la pantalla el valor en
Transmitancia.
5.-Si desea imprimir, oprima <PRINT> para avance de papel y/o una
segunda vez para la impresión en el papel del espectrofotómetro o <SECND
REMOTE> para mandar a un dispositivo
externo (a la computadora).
6.-Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta
y guárdela).
7.- para entender lo hablado ver la imagen siguiente:
8.-Si no va usar más el aparato, apáguelo y cúbralo, si desea continuar
trabajando, elija el modo de trabajo siguiente y continúe.
Resultado:
Este fue el resultado que nos salió en el
espectrofotómetro.
Cálculos:
.461/.472 x 15 = 14.65
Rango:
normal ya que era la muestra de una mujer
Cálculos:
Hb total = concentración
de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).
en espectofotometro se aplica la siguiente formula:
muestra/ estandar x 15 = Hb
en espectofotometro se aplica la siguiente formula:
muestra/ estandar x 15 = Hb
Valores de referencia:
Niños al nacer…………………………….. 13,6 - 19,6 g/dL
Niños de 1 año…………………………..... 11,3 - 13,0 g/dL
Niños de 10 -12 años……………………... 11,5 - 14,8 g/dL
Mujeres……………………………………... 11,5 - 16,5 g/dL
Hombres……………………………………. 14,0 - 18,0 g/dL
Observaciones:
Al hacer la práctica notamos que para determinar este volumen que existe de
Hb circulante en la sangre es fácil y sencillo de sacar ya que a la hora de
meterlo al espectrofotómetro prácticamente nos dice todo solo hay que sacar el
resultado haciendo la operación básica que ya nombramos anteriormente.
Los exámenes de laboratorio pueden realizarse por
muchas razones, como investigación rutinaria de salud o sospecha de enfermedad
o de toxicidad. También pueden ser utilizados para determinar si la efectividad
de un medicamento mejora o empeora. Los exámenes pueden medir el éxito o
fracaso de un tratamiento. Pueden ser solicitados por razones médicas o
legales. Las siguientes son posibles razones por las que este examen puede
realizarse:
- Acidosis láctica
- Anemia de células falciformes
- Anemia por deficiencia de hierro
- Embolia grasa
Conclusiones:
Existen varios factores para
determinar cuándo y con qué frecuencia se pueden realizar los exámenes. Su
duración puede depender de los resultados o terminación de otros exámenes,
procedimientos o tratamientos. Los exámenes pueden ser realizados
inmediatamente en una emergencia o pueden ser demorados conforme una condición
es tratada o monitoreada. Se puede sugerir un examen o llegar a ser necesario
cuando aparecen ciertos signos o síntomas.
Debido a
cambios de las funciones naturales del organismo durante el día, los exámenes
pueden ser realizados en una determinada hora. Si usted se ha preparado para
este examen con cambios en la ingesta de comida o líquidos, los exámenes pueden
ser realizados de acuerdo con estos cambios. Los intervalos para la realización
de los exámenes pueden basarse en el aumento o disminución de los niveles de
medicamentos, drogas u otras sustancias en el organismo.
La edad o el
género de las personas pueden influir en la fecha y la frecuencia con que se
requiere un examen. Las condiciones crónicas o progresivas pueden necesitar un
monitoreo continuo mediante exámenes. Ciertos exámenes pueden ser repetidos
para obtener una serie de resultados o para confirmar o refutar resultados. Las
veces que deban realizarse los exámenes y su frecuencia varían dependiendo si
se llevan a cabo por razones profesionales o legales.
Referencias:
·
Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas
Escrito por Bernadette F. Rodak
Pag. 171.
·
Laboratorio de diagnóstico clínico
Escrito por Díaz Martín, Gustavo
A.
Pag. 395-396
